Experimente:
Versuch: Reaktionsspezifität der Urease

Gleich vorneweg ein Hinweis: Dies ist eine Anleitung, die zwar für die Schule oder einfache Ausbildungsstätten geeignet ist, jedoch nur begrenzt für die Lehre an Universitäten eingesetzt werden kann.

Zunächst sollte man das Enzym anhand qualitativer oder halbquantitativer Versuche vorstellen.

Zur quantitativen Analyse nach Michaelis-Menten benötigen wir die Reaktionsgeschwindigkeit (genau genommen: die Anfangsgeschwindigkeit v₀ der Enzymreaktion) in Abhängigkeit von der Substratkonzentration. Zur Messung nutzen wir die Änderung der elektrischen Leitfähigkeit einer Harnstofflösung aus (Konduktometrisches Messverfahren). Lösungen von Harnstoff selbst leiten den elektrischen Strom nicht, wohl aber die der Reaktionsprodukte (NH₄⁺-, HCO₃^-- und OH^--Ionen). Man kann sich eine Apparatur zur Messung von Leitfähigkeiten im Bereich um 10⁴ Siemens selbst zusammenstellen (Siemens steht für V · A^-1 oder reziproke Ohm (= mho)). Man benötigt dazu eine Wechselstromquelle für eine Spannung von etwa 10 Volt und ein Amperemeter (Messbereich 3 bis 30 mA).

Messapparatur zur Konduktometrie

Besser geeignet sind jedoch käufliche Konduktometer, da diese die Leitfähigkeiten mit hochfrequentem Wechselstrom zu messen gestatten.

Als Elektroden nehmen wir blanke Platinblechelektroden. Es ist wichtig, dass deren Abstand stets gleich bleibt. Der Messbereich hängt von Abstand, Größe und Oberflächenbeschaffenheit ab. Deshalb ist es gut, wenn man vorgefertigte Leitfähigkeitsmesszellen nimmt. Eine Ermittlung der Zellkonstanten ist für die Messung nicht notwendig!
Noch ein Hinweis: Platinierte Elektroden sind empfindlich gegen Proteine. Sie können jedoch mit Natriumdodecylsulfonat gereinigt werden, das in Feinwaschmitteln wie FEWA enthalten ist. Man kann sich daher dieser Waschmittel bedienen. Vor und zwischen den Versuchen sind die Elektroden gut abzuspülen.
Die Lösungen sollten in sauberen Bechergläsern hergestellt werden, die möglichst identisch sind, auch in Bezug auf die Glasqualität. Sie werden vor den Versuchen einige Tage in destilliertem Wasser gewässert, um zu große Leitfähigkeitsunterschiede der Harnstofflösungen zu vermeiden. Auf diese Weise reicht für die Aufnahme der Kinetik erfahrungsgemäß ein Messbereich am Konduktometer aus.

Lösungen zur Ureasekinetik
A Harnstofflösungen
Man löst 1 g Harnstoff in 1 l destilliertem Wasser.
Daraus stellt man Verdünnungen her und berechnet die Substratkonzentration [S]:

ml Harnstofflösung	ml dest. Wasser	[S] g / l
10 10 10 10 10 10 10	10 20 30 40 50 60 70	1/2 1/3 1/4 1/5 1/6 1/7 1/8

B Ureasesuspension
Man gibt 10 mg Urease (zum Beispiel von Merck) in 10 ml destilliertes Wasser und schüttelt gut um. Zum Pipettieren lohnt sich der Einsatz eines kleinen Rührwerks.

Ablauf der Messungen
a Vormessung zur Bestimmung der Eigenleitfähigkeit der Ureaselösung
10 ml von demjenigen destillierten Wasser, das als Lösungsmittel für Harnstoff dient, werden in ein Messgefäß gegeben. Der Eigenleitwert des Wassers (L_H2O) wird gemessen und notiert. Nun gibt man 1 ml der gerührten Ureasesuspension zu und misst erneut. Die Differenz der beiden Messungen ist der Eigenleitwert der Urease (L_Urease). Während der Messung muss gerührt werden.

b Messungen der Ureasekinetik
10 ml Harnstofflösung werden in das Messgefäß gegeben; der Leitwert der Lösung (L_Lösg) wird gemessen und notiert. Mit der Zugabe von 1 ml der gerührten Ureasesuspension setzt man die Stoppuhr in Gang. Man misst nach 2 Minuten den Leitwert L₁₂₀. (Der Leitwert ist der Kehrwert des gemessenen Widerstands.)

Berechnung der Reaktionsgeschwindigkeit
Als (wenn auch etwas grobes) Maß für die Anfangsgeschwindigkeit v₀ der Enzymreaktion wird die folgende Differenz gewählt:

DL₁₂₀ = L₁₂₀ - ( L_Lösg + L_H2O + L_Urease)

Bestimmung des K_M -Wertes der Urease
Man trägt in einem Diagramm 1 / DL₁₂₀ gegen 1 / [S] auf:

Kinetik der Urease. Auftragung nach Lineweaver-Burk

Aus dem Abszissenabschnitt wird 1 / K_M = 3,0 l / g abgelesen; daraus folgt K_M = 0,33 g Harnstoff / l oder 5,6 · 10^-3 mol / l.
(Der Vergleichswert der Literatur ist 0,63 g / l beziehungsweise 1,05 · 10^-2 mol / l.)

Quelle:
nach: R. Blume und H. Wenck: Enzymatisch aktive Proteine. In: Der Chemieunterricht CU 11 (1980), Heft 4.

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