Prof. Blumes Tipp des Monats Oktober 1999 (Tipp-Nr. 28)


Beim Experimentieren den Allgemeinen Warnhinweis unbedingt beachten.


Proteasenwirkung - schnell sichtbar gemacht

Zur Demonstration von Enzymreaktionen in der Sekundarstufe I sind besonders die Verdauungsenzyme geeignet.

- Den Stärkeabbau durch Amylasen zeigt ihr anhand der Entfärbung der blauen Lösung des Iod-Stärke-Komplexes.
- Da bei der Hydrolyse von Fetten durch Lipasen Säuren entstehen, entfärbt sich eine durch Zusatz von Natronlauge und Phenolphthalein rot gefärbte Fett-Emulsion.
- Unter der Einwirkung von Proteasen zersetzt sich gekochtes Fleisch (am besten Kochfisch).

Während die Reaktionen bei beiden erstgenannten Enzymen schnell und deutlich ablaufen, dauert es bei den Proteasen sehr lange, bis ein Ergebnis vorliegt. Und das ist dann auch nicht einmal besonders deutlich, da sich auch das Fleisch in der Vergleichslösung ohne Enzymzusatz zerfasert und anscheinend auflöst. Deshalb ist auch für die Proteasen ein einfacher Farbtest wünschenswert.

Einen solchen Test gibt es. Hierzu nutzen wir aus, dass die großen Eiweißmoleküle den Farbstoff Kongorot fest an sich binden (adsorbieren). (Der Grund für die feste Bindung des Kongorots an Proteine liegt in seiner planaren Struktur und in seinen Ladungen.) Wird das Eiweißmolekül in kleine Stücke zerlegt, so wird der Farbstoff wieder freigesetzt und geht in die Lösung über. Die Lösung wird also durch die Wirkung der Proteasen rot gefärbt.

Aufgrund seiner Struktur vermag sich Kongorot fest an Proteine zu binden.

Proteasen greifen nur denaturiertes Eiweiß an. Deshalb müssen wir das Eiweiß vor dem Versuch kochen.

Versuch 1: Färben von Hühnereiweiß (nach [1,2])
Sicherheitshinweis:
Lehrerversuch! (Kongorot ist als Abkömmling des Benzidins nicht mehr für Schülerversuche erlaubt, da Benzidin als mögliches Abbauprodukt als krebserzeugend eingestuft ist.)

Zwei Hühnereier werden hart gekocht. Wir trennen das Eigelb heraus und zerkleinern das Eiweiß. Dann geben wir es zusammen mit 10 ml Kongorot-Lösung (w = 0,5 %, Lösemittel ist 10%iges Ethanol) in einen Mörser und zerreiben es gut. Die so erhaltene Masse füllen wir in ein kleines Becherglas und erwärmen dieses in einem Wasserbad langsam auf 80 °C und lassen die Hitze noch weitere 5 Minuten einwirken. Dann filtrieren wir die Masse ab und lassen sie eintrocknen. Anschließend zerbröseln wir die Stücke und füllen sie in eine gut verschließbare Flasche ab. Ihr solltet euch einen größeren Vorrat an gefärbtem Protein herstellen. Denn das trocken und verschlossen aufbewahrte Eiweiß-Kongorot-Adsorbat ist jahrelang haltbar.

Als Proteasen verwenden wir Pepsin aus dem Magensaft und die Proteasenmischung aus dem Pankreas, die im Darmsaft wirkt. Die Mischung aller Pankreas-Enzyme ist unter dem Namen "Pankreatin(R)" käuflich. Sie enthält verschiedene Proteasen (vor allem Chymotrypsin und Trypsin) sowie Lipasen und Amylasen und ist für alle grundlegenden Enzymversuche zur Verdauung nutzbar.
Ihr müsst auch an den pH-Bereich denken, bei dem die Enzyme optimal arbeiten. Pepsin arbeitet im sauren Magensaft bei pH 2 - 3, Pankreatin im alkalischen Darmsaft bei pH 9.

Versuch 2: Wirkung von Proteasen auf mit Kongorot gefärbtes Eiweiß
Lehrerversuch

Stelle zuvor folgende Lösungen her:

  • A Salzsäure (c = 0,01 mol/l) (Xi)
  • B Natriumcarbonat (w = 1 %)
  • C Natriumhydrogencarbonat (w = 1 %)

Mische 10 ml Lösung B mit 80 ml Lösung C. Dies ist der Reaktionspuffer für das Pankreatingemisch.

Fülle in 4 Reagenzgläser jeweils etwa 1 cm hoch Krümel der Eiweiß-Kongorot-Mischung. Beschrifte die Gläser mit den Ziffern 1 bis 4. Dann gibst du wie folgt Lösungen und Enzyme zu.

  • Glas 1 10 ml Salzsäure
  • Glas 2 10 ml Salzsäure + Spatelspitze Pepsin
  • Glas 3 10 ml Puffer pH 9,1
  • Glas 4 10 ml Puffer pH 9,1 + Spatelspitze Pankreatin
(Die Gläser 1 und 3 dienen als Vergleich.)

Schüttle die Gläser kurz durch und lasse sie dann stehen. Nach ca. 10 Minuten, spätestens jedoch nach einer halben Stunde beobachtest du, dass in den Gläschen mit den Enzymen der Farbstoff aus der Oberfläche des rot gefärbten Hühnereiweißes austritt und die Lösung färbt. Die Proben ohne Enzymzusatz setzen kein Kongorot frei. Der Effekt verdeutlicht sich, wenn du alle Gläser ab und zu vorsichtig schüttelst.

Versuchsergebnisse (Foto: Daggi)

Rüdiger Blume


Weitere Tipps des Monats


Literatur:
1. H. Hassinger, R.-D. Wiebusch: Experimentelle Enzymologie, Verlag Diesterweg-Salle, Frankfurt a. M. 1977
2. Brigitte Stellmach: Qualitative Versuche zur Wirkung von Proteasen, Schriftliche Hausarbeit im Rahmen der Ersten Staatsprüfung für das Lehramt der Sek. I, Bielefeld 1981

Diese Seite ist Teil eines großen Webseitenangebots mit weiteren Texten und Experimentiervorschriften auf Prof. Blumes Bildungsserver für Chemie.
Letzte Überarbeitung: 12. August 2008, Dagmar Wiechoczek