Enzymatische Bestimmung der Ascorbinsäure

Ascorbinsäure wird heute normalerweise mit der HPLC bestimmt. Die einzige nass-chemische Methode zur Bestimmung der Ascorbinsäurekonzentration, die im lebensmittelchemischen Labor auch heute noch wirklich angewendet wird, ist die so genannte Enzymatische Methode. Wie wir gleich sehen werden, spielt das Enzym - die Ascorbat-Oxidase (AAO) - jedoch nur eine Hilfsrolle. Und wahrscheinlich gerade weil die Methode so kompliziert ist, hat sie auch schon in deutschen Schulstuben als Facharbeitsthema Einzug gehalten.

Das Verfahren beruht darauf, dass man zunächst alle reduzierenden Substanzen in einer Lösung (zum Beispiel einem Getränk) mit einem Stoff oxidiert, der dabei in eine farbige Form, ein Formazan, übergeht. Dieser Stoff heißt MTT (oder ganz einfach nur 3-(4,5-Dimethylthiazolyl-2)-2,5-Diphenyltetrazoliumbromid). Zur Reaktion benötigt er noch einen Katalysator (man spricht von einem Mediator), der die Elektronen überträgt: PMS (kurz genannt auch 5-Methylphenaziniummethosulfat).

AscH2 + MTT+ ———> Ascox + MTT-Formazan + H+

Der gebildete, blaue Farbstoff absorbiert bei 578 nm. Aus der Extinktion der Farbstofflösung wird mit Hilfe des Lambert-Beerschen Gesetzes seine Konzentration bestimmt. Sie gibt direkt Aufschluss über den Summenwert der Konzentrationen der reduzierenden Substanzen in der untersuchten Lösung.

Man geht wie folgt vor: In einem ersten Probenansatz wird durch Oxidation mit MTT die Summe der Konzentrationen aller reduzierenden Substanzen gemessen. Dann wird in einem zweiten Ansatz mit frischer Probe der Ascorbat-Anteil entfernt. Das geschieht durch Oxidation mit Hilfe der AAO.

AscH2 + ½ O2 ———> Ascox + H2O

Anschließend wird auch diese Probe mit MTT oxidiert. Die Differenz zwischen den MTT-Formazan-Konzentrationen in den beiden Proben ergibt die Konzentration an Ascorbinsäure.

Da die Methode kompliziert ist und viele Schwierigkeiten bei der Probennahme sowie bei der Probenvorbereitung bestehen (vor allem, wenn es sich um farbige Lösungen handelt), verzichten wir auf eine genauere Darstellung der Prozedur.

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Letzte Überarbeitung: 12. Februar 2004, Dagmar Wiechoczek